二糖酶测试盒的酶促反应
发布时间:2023/12/12 8:59:24 已浏览次数: 122 次

 二糖酶测试盒的酶促反应

(测麦芽糖酶)

一、测定原理：

麦芽糖酶（Lactase）作用于相应的底物产生单糖，

该单糖在其氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢同

显色剂结合产生红色的产物，用分光光度计测定其光密

度值，从而测定出麦芽糖酶的活性。

二、试剂的组成和配制（25T～100T）：

试剂一：粉剂×1 瓶，10mL 稀释液×1 瓶，无色透明液体；

2～8℃保存。

底物的配制：在试剂一粉剂中加入 10mL 的稀释液，充

分溶解后，备用；2～8℃保存。

试剂二：终止剂 5mL×1 瓶，2～8℃保存。

试剂三：50mL 液体×1 瓶，2～8℃保存。

葡萄糖标准液：5.55mmol/L，液体，2～8℃保存。用时

按体积比 1:2 的比例加蒸馏水稀释成

1.85mmol/L 葡萄糖标准液。

三、操作表：

1、样本处理:

①、液体样本：直接测定，如超过线性范围用生理盐

水稀释后测定。

②、组织样本：准确称取组织重量,按重量(g)：体积

(mL)=1：9 的比例，加入 9 倍体积的匀浆介质，

冰水浴条件下机械匀浆,2500 转/分,离心 10 分钟，

取上清液待测。[注]:匀浆介质可用磷酸盐缓冲液

(0.1mol/L pH 7.4)或生理盐水（0.9%）；

③、细胞样本：

A、细胞收集:将制备好的细胞悬液取出，1000

转/分，离心 10 分钟，弃上清液，留细胞沉淀；

用等渗缓冲液（推荐 0.1mol/L 、pH7～7.4 磷

酸盐缓冲液）清洗 1～2 次，同样 1000 转/分，

离心 10 分钟，弃上清液，留细胞沉淀；

B、细胞破碎:加入 0.2～0.3mL 的匀浆介质（推

荐 0.1mol/L pH7～7.4 磷酸盐缓冲液或生理

盐水）进行匀浆，冰水浴条件下超声破碎(功

率:300W,3～5 秒/次,间隔 30 秒，重复 3～5

次)或手动匀浆，制备好的匀浆液不离心直接

测 定 。 也 可 采 用 裂 解 液 裂 解 ( 推 荐

TritonX-100，1～2%,裂解 30～40 分钟),裂解

好的液体不离心直接测定。[注]：建议细胞密

度在 100 万个/mL 以上。破碎好的液体可显

微镜观察细胞是否破碎完全。

2、酶促反应：（可用离心管操作）

[注]：在做正式实验前，先要取个别样本（可以挑选正常组一

个和模型组一个）进行浓度梯度预试（稀释倍数可选 5

倍、10 倍、20 倍或其它），以确定最佳取样浓度（最佳

浓度时，测定 OD－对照 OD 接近标准 OD 即可；当然，

样本本身酶活力偏低时，直接原液测定甚至可以加大酶

促反应取样量或延长酶促反应时间）。

四、计算公式：

1、液体样本计算：

单位定义：在 37℃ PH6.0 的条件下，每毫升样本每分钟

水解 1nmol 麦芽糖定义为 1 个酶活力单位。

计算公式：

 二糖酶测试盒的酶促反应